第1章 デスレセプターによる細胞生死決定
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米原伸
キーポイント
われわれの身体を構成する細胞は、自らをアポトーシスで除去するためのデスレセプターを発現する
デスレセプターに刺激が入ると、アダプター分子FADDを介してcaspase-8前駆体を含む複合体DISCが形成され、DISC内でcaspase-8が自己切断によって活性化し、カスパーゼカスケードが発動し、アポトーシスが誘導される
デスレセプターを介するアポトーシスシグナルは、FLIPという分子の細胞内の発現によって抑制される
FLIPはがん細胞やウイルス感染細胞、また働く必要のあるリンパ球がデスレセプターを介するアポトーシスから免れるために機能している
FADD, capase-8やFLIPはアポトーシス誘導シグナルとは無関係のNF-κBの活性化やWntシグナルなどの生体にとって重要なシグナル系にも深く関わっている
はじめに
デスレセプター
生理的なリガンドの作用によってアポトーシス誘導シグナルを細胞内に伝達する細胞表層レセプター分子であり、6種類が知られている
Fas
アポトーシス誘導レセプターとして発見され、インパクトを与えた分子
デスレセプターは進化的には、哺乳動物あたりから獲得されたシステムと考えられるが、そのアポトーシス誘導シグナルにかかわる分子は進化的にも魚類や昆虫にも存在している
もとは異なったシグナル伝達に関わっていた分子を巧みに利用したのかもしれない
1. デスレセプターとそのアポトーシス誘導シグナル
デスレセプター
TNF(腫瘍壊死因子:tumor necrosis factor)レセプターファミリーに属するレセプターファミリー
TNFレセプターファミリー
細胞外領域にシステイン残基に富む繰り返し構造を持つI型膜タンパク質のレセプターファミリー
リガンドは、TNFファミリーに属するII型膜タンパク質であるが、膜上のメタロプロテアーゼによって切断されて可溶性因子としても作用する
これに属する分子には生体にとって重要な様々な機能を持つ
細胞の死、細胞の生存、免疫細胞の活性化、骨の形成、リンパ節の形成など、
細胞内領域にDD(death domain:デスドメイン)と呼ばれるI型膜タンパク質であり、アポトーシスの誘導に必須のドメインをもち、アポトーシス誘導シグナルを細胞内に伝達するレセプター
ヒトやマウスでは6種類のデスレセプター分子が知られている
主要な分子としてFas, TNFレセプターI(TNFR I), TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)レセプター(DR4/TRAIL-R1とDR5/TRAIL-R2)
これに対応するリガンドにはそれぞれ, TNF-αとTRAILと呼ばれ、すべてTNFファミリーに属するII型膜タンパク質
膜タンパク質
I型
C末端側を細胞内にもつ一回膜貫通タンパク質
II型
C末端側を細胞外に、N末端側を細胞内にもつ一回膜貫通タンパク質
特異的な分解酵素により細胞外領域で限定分解を受けた可溶性Fasリガンド、TNF-αとTRAILも存在し、可溶性の細胞死誘導因子として機能することもある
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抗Fas抗体の発見からアポトーシスを誘導するレセプターの存在という新しい概念の提唱
ヒト細胞表層に結合するモノクローナル抗体のスクリーニングを行っていたところ、ある特別の抗体が細胞に結合するだけで再防止を誘導する不可思議な現象を偶然見出し、この抗体を抗Fas抗体と命名した
cDNAクローニングによってこの抗体が認識する分子Fas(抗原)がTNFレセプターファミリーに属することが示されることにより、抗体が結合するとアポトーシスが誘導されるという不思議な現象からアポトーシスを誘導するレセプターの存在という新しい概念の提唱へとつながることとなった
哺乳類細胞におけるアポトーシスの研究において、デスレセプターを介するアポトーシスの研究はいくつかの点で重要な意味をもっている
細胞死の概念に影響を及ぼした
Horvitzらの線虫を用いた遺伝学的な解析によって細胞死が遺伝子に仕組まれた生体の有する積極的な機構であることが証明された
→細胞死が厳密に制御されている現象であるという認識が行き渡った
我々とドイツのKrammerのグループが独立に、かつお互い偶然に、細胞死を誘導するモノクローナル抗体を調製し、デスレセプターの発見につながった
→我々の身体を構成している細胞が、自爆するためのレセプターを発現しているという新しい概念が確立した
アポトーシス誘導シグナルの研究に大きな役割を果たした
細胞増殖シグナルの研究においても増殖因子レセプターからのシグナル解析が大きな役割を果たしてきた
細胞外からシグナルを同時に、かつ実験者の手による増殖因子の添加によって付与することにより、シグナルの流れを時間を追って着実に解析することが可能であったということは、シグナルの流れを解析する上で重要な意味を持っていた
細胞死においても、細胞増殖シグナルと基本的に同じ方法を用いてシグナル伝達の研究を実行する土台が提供されていた
しかも、Fasを刺激すると短時間で典型的なアポトーシスを誘導することができたために、アポトーシスという現象を自らの手で誘導し、実感することを世界中の研究者ができるようになり、アポトーシスの研究を飛躍的に進めることに繋がった
アポトーシスの誘導はカスパーゼカスケードの活性化が中心的なシグナルとなる
カスパーゼ(caspase)はN末端側から、プロドメイン・大サブユニット・小サブユニットがつながった前駆体として存在し、切断され、大サブユニットと小サブユニット2つずつから成る四量体の活性化型プロテアーゼとなる
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カスパーゼカスケードと呼ばれる理由は、開始カスパーゼから実行カスパーゼへとシグナルが伝わり増幅されるから
開始カスパーゼ(イニシエーターカスパーゼ)と呼ばれるカスパーゼが自己切断によって活性化する
前駆体でも弱いプロテアーゼ活性の存在することが開始カスパーゼの条件となる
活性化した開始カスパーゼがcaspase-3とcaspase-7という実行カスパーゼ(多量に存在する)を切断活性化することによってシグナルが増幅され、活性化した実行カスパーゼが様々なデスサブストレートと呼ばれる基質を切断することによってアポトーシスが実行される
デスレセプターを介するアポトーシス誘導シグナルはFasの系が代表として解析されてきたが、他のデスレセプターからのアポトーシス誘導シグナルも基本的に同じシグナルを利用している
Fasはアポトーシスを強く誘導するが、他のデスレセプター分子はアポトーシス以外のシグナルも強く導入することが多い
Fasを介するアポトーシス誘導シグナル→図1
Fasは三量体として細胞膜上に存在し、同じく三量体のFasリガンドや多価のアゴニスティック抗ファスモノクローナル抗体(IgMや凝集体を作るIgG3など)が作用すると、さらに凝集することなどにより構造変化が引き起こされると考えられている
アゴニスティック抗体
生理的リガンドと同じ活性を示すもの
アンタゴニスティック抗体
リガンドの作用を阻害するもの
その結果、Fasの細胞内領域に存在するDDにFADD(Fas-associated death domain)が会合する
FADDはC末端側にDDをもち、N末端側にDED(death effector domain)をもつアダプター分子
DDやDEDは、αヘリックス構造を繰り返してもつ分子であり、基本的にホモフィリックな相互作用を行う
FASのDDとFADDのDDが会合し、FADDのDEDにDEDをもつ分子が会合する
その分子は、プロドメインにDEDをもつ開始カスパーゼであるcaspase-8/FLICE(FADD-like interleukin-1-converting enzyme)
そして少なくともFAS・FADD・caspase-8から成るDISC(death-inducing signaling complex)と呼ばれる複合体が形成され、DISCの中で、近接化したcaspase-8の前駆体同士が隣の自分を切断して活性化する
また、プロドメインであるDEDが切り離されるので、活性化したcaspase-8はDISCから遊離し、実行カスパーゼであるcaspase-3やcaspase-7を切断して活性化させる
一方、caspase-8が実行カスパーゼを直接切断せずにアポトーシスを誘導する系も存在する
caspase-8はアポトーシスを誘導するBcl-2ファミリーのBh3 onlyタンパク質の一つであるBidを切断する
切断されたBidはミトコンドリアに作用して、シトクロムcのリリースから開始カスパーゼであるcaspase-9の活性化を誘導して、アポトーシスを誘導する
Type I細胞
caspase-8が直接実行カスパーゼを切断してアポトーシスを誘導する細胞
活性化した免疫系の細胞が代表例
Type II細胞
caspase-8が直接実行カスパーゼを切断できずに、Bidを切断してアポトーシスを誘導する細胞
肝臓の実質細胞が代表的な例
Type I細胞とType II細胞を分ける説明は決着がついていない
細胞固有の性質として異なっているという説
Fasからのシグナルの強さだけがこの違いを規定するという説
2. デスレセプターを介するシグナルの制御
Bcl-2やBcl-xLの効果は細胞により異なる
Type Iに分類される細胞では、デスレセプターからのアポトーシス誘導シグナルはミトコンドリアを経由せず、抗アポトーシス分子であるBcl-2やBcl-xL(ミトコンドリアを保護する)では抑制できない
Type IIに分類される細胞では、Bcl-2やBcl-xLによってアポトーシスが阻害されることになる
実際に、培養細胞レベルでFas誘導アポトーシスがBcl-2やBcl-xLで抑制できない細部と、抑制可能な細胞が存在する
また、in vivoでも、Fasを介したアポトーシスが重要な役割を果たしていることが示された系で、Bcl-2の効果が異なる細胞が知られている
末梢における免疫細胞の活性化に伴う除去はBcl-2では阻害できない
アゴニスティック抗Fasモノクローナル抗体をマウスに投与すると誘導される劇症肝炎は、Bcl-2の発現やBidのノックアウト(KO)によって阻害されることが報告されている
Type Iに分類される細胞でFasを介するアポトーシスを阻害する分子は存在するか
現在のところ、FLIP(FLICE/caspase-8-inhibitory protein)と呼ばれるタンパク質がFas誘導アポトーシスをcaspase-8活性化の上流で阻害できる分子として知られている
FLIPは2つの連なったDEDをもつ分子で、いくつかの分子種が存在する
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最初に発見されたFLIPはウイルス由来のviral FLIP(v-FLIP)
γタイプのヘルペスウイルスやアルシュのポックスウイルスがコードする分子の中にDEDが2つ連なった分子が同定され、これがFasを介するアポトーシス誘導シグナルを強力に遮断することが明らかとなった
具体的にはウマγ型ヘルペスウイルスのE8、ヒトカポシ肉腫を発症させるヘルペスウイルス8のK13、ポックスウイルスのMC159などがv-FLIPとして同定され、Fasを介するアポトーシスを強力に抑制することが明らかとなった
一方、哺乳類細胞自身もv-FLIPの相同分子cellular FLIP(c-FLIP)をもつ
2つのスプライシングバリアントが存在する
c-FLIPS(short form)
v-FLIPと同様に、ほぼ2つのDEDのみから構成される
c-FLIPL(long form)
caspase-8と構造が似ており、DED2つとプロテアーゼ様領域を有するが、カスパーゼの活性中心に対応するアミノ酸残基に変異が存在し、プロテアーゼ活性が不活化されている
また、大サブユニットと小サブユニットに相当する領域の間はカスパーゼで切断されるが、プロドメイン(DED)と大サブユニットの間は切断されない
FLIPがFasを介するアポトーシスを抑制するメカニズムは2つ
DEDのみをもつ短いFLIP(v-FLIPとc-FLIPS)は、caspase-8のFADDへの会合を競合的に阻害し、DISC形成を抑制する
c-FLIPLはこの活性に加え、DISC内に混入することによってcaspase-8同士の近接化を阻害し、近接化による隣接したcaspase-8間の切断反応をも抑制するという
実際に、FLIPによってFas誘導アポトーシスが阻害されるときには、DSICへのcaspase-8の導入が阻害されるし、DISC内でのcaspase-8の切断も阻害されることがわかっている
Fasを介するアポトーシスは、免疫系の細胞傷害性T細胞やNK細胞がウイルス感染細胞やがん化した細胞にアポトーシスを誘導する際に機能することが知られている
ウイルスはv-FLIPを発現することにより、ホストの免疫系からの攻撃から逃れることができる
一方、c-FLIPは免疫系のT細胞が抗原の刺激を受けると発現が誘導され、抗原刺激を受けて機能しなければならない細胞がFasを介するアポトーシスを免れることに寄与することが示されている
また、種々の腫瘍細胞はFasを介するアポトーシスシグナルに耐性を獲得し、ホストの免疫系からの攻撃を免れている場合があるが、この場合にもc-FLIPが機能していることが明らかになった
また、活性化型Rasを発現させると線維芽細胞がFasを介するアポトーシスに耐性となるが、このときにも、Ras→MAPK/ERK→AP-1の下流でc-FLIPの発現増強が誘導されることもわかっている
また、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤をがん細胞に作用させるとFasを介するアポトーシスシグナルに感受性を示すことが知られていたが、これもc-FLIPの発現を減少させることによることが明らかとなった
3. デスレセプター下流のアポトーシスシグナル分子のもつ多用な生理機能
lprとgldという自己免疫疾患モデルマウスとして古くから知られていたマウスは、それぞれFasとFasリガンドの機能不全マウスであった
lprマウスとgldマウスはリンパ節や脾臓において、lpr細胞と呼ばれる特殊なT細胞が蓄積するという前がん状態と、抗DNA抗体などの自己抗体を産生する、自然に発生したミュータントマウス
これらの変異をMRLという系統のマウスに導入すると、全身性の自己免疫疾患を発症する
Fasシステムは自己反応性のリンパ球の末梢組織における除去などの免疫系の制御やがん細胞やウイルス感染細胞の免疫細胞による除去に機能することが明らかとなった
しかし、lprマウス、gldマウスやFasノックアウトマウスは個体の発生は正常で、子どもをつくることも可能だった
→Fasシステムは個体発生には関与していない
https://gyazo.com/94324a7d021084e895be21fcfb407fc0
また、TNFR IやTRAILのノックアウトマウスは、免疫系などで少し異常が認めれるがFasほどの異常もなく、個体発生も正常であった
一方、デスレセプターの下流でアポトーシス誘導シグナルに関わるFADDのノックアウトマウスが胎生致死であることが判明し、caspase-8のノックアウトマウスも誕生しなかった
これらは胎生10.5~11.5日で心臓の異常により死亡する
デスレセプターやデスリガンドのノックアウトマウスでは認められない現象であり、他のデスレセプターが個体の発生に必須であるか、FADDとcaspase-8はデスレセプター下流のシグナル以外でも機能していることが考えられた
さらに、デスレセプター下流でのcaspase-8の活性化を阻害するc-FLIPのノックアウトマウスが、同じ心臓の異常によって胎生致死となることが報告された
FADD, caspase-8, c-FLIPはデスレセプターとは別のシグナル系に関与し、それが心臓の発生に必要であることが考えられた
われわれが作製したcaspase-8ノックアウトマウスでは、胎生11.5日で心筋細胞がアポトーシスに陥って死滅することにより心臓から血液が漏れ出てマウスは死亡する
カスパーゼが除去されると、アポトーシスが誘導されるという説明しがたい結果
また、胎仔をとりかこむ羊膜上の血管が再編成の異常により認められなくなり、本来まっすぐ伸びる神経管がジグザグになるという異常が認められた
このような異常が生じた原因は明らかになっていないが、デスレセプター下流でアポトーシス誘導に必須のFADD・caspase-8や抑制にかかわるc-FLIPが発生途上の心筋細胞の生存や血管の再編成、神経管の形成にかかわるという事実が明らかになった
また、われわれはv-FLIP E8のトランスジェニックマウスの作製を試みたが、身体全体で発現させたマウスは誕生しなかった
このような状況から、FADD・caspase-8やc-FLIPがアポトーシス誘導シグナル以外の機構に関わっている可能性が予想された
この点で注目されるのが、FADDやcaspase-8のノックアウトマウス胚とリンパ球のないRagノックアウトマウス胚のキメラマウスのT細胞や、これらの分子のT細胞特異的なコンディショナルノックアウトマウスのT細胞の解析
これらのT細胞では、胸腺でのT細胞分化が阻害されていたり、成熟したT細胞の抗原レセプター刺激による活性化や増殖に欠陥のあることが報告されている
一方ヒトにおいては、caspase-8のプロテアーゼ活性を失う遺伝子変異が見つけられ、そのT細胞は抗原刺激によるIL-2生産が低下しているが、抗原刺激をまねるフォルボルエステルとイオノマイシン刺激によるIL-2生産は正常であると報告された
さらにごく最近、抗原刺激やToll-likeレセプターを介するNF-κBにcaspase-8が必要であることが報告され、その分子機構も解明されようとしている
→3. caspase-8はアポトーシス誘導だけでなく免疫細胞におけるNF-κB活性化にも関与する
一方ヒト腎臓由来の293細胞におけるRNAi法によってcaspase-8の発現を抑制すると、TNF-α刺激によるNF-κBの活性化には影響はないが、Fas刺激によるNF-κBの活性化が全く誘導されないという
これらの報告から考えると、FADDとcaspase-8はデスレセプターを介するアポトーシス誘導シグナル以外に少なくともNF-κBの活性化に関わるシグナルを含む別のシグナル系に関与するということになる
NF-κB以外のシグナル系との関連でも、興味深いことがわかっている
われわれは、v-FLIP E8が基本的にすべての細胞でWntシグナルを強力に増強することを見出した
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E8はβ-cateninの安定化の下流でβ-cateninと転写因子TCFが共同して実行する転写を増強する
デスレセプターを介するアポトーシスを制御する分子がWntシグナルとまで関わりを持っていることが明らかとなった
Wntシグナルとの関連では、c-FLIPLがβ-cateninの安定化を誘導するという報告もあり興味深い
ただし293T細胞という細胞株においてだけ
さらに、ヒト神経芽細胞腫(neuroblastoma)ではcaspase-9の遺伝子変異や発現抑制が高頻度で認められ、caspase-8ががん抑制遺伝子産物であることが示唆されていたが、これがneuroblastomaの転移抑制と密接に関連することが報告された
→4. caspase-8はneuroblastomaの転移抑制に関与するがん抑制遺伝子産物である
4. 今後の研究の展開
デスレセプターからのシグナル伝達機構の研究
世界中の多くの研究者が参加し、その結果、瞬く間にそのシグナル伝達の大筋が明らかになった
その後は、その制御機構を明らかにすることが問題となったが、FLIPによる抑制機構が大きな意味をもつことが判明するに至っている
現在では、FLIPまでを含めたデスレセプターからのシグナル伝達分子が、細胞死以外の重要な生理機能を担っていることが判明し、その生理機能の実態と分子機構の解明が大きな課題
NF-κBの活性化にかかわる分子機構は、今まさに解明されつつあるが、これらの分子のノックアウトマウスで心臓の形成、血管再編成、神経管の形成に異常が誘導される原因については未だに明らかではない
また、NF-κBの活性化も含めて、caspase-8のプロテアーゼ活性が必要でないと考えられるので、その多様な機能に関わる生理的な基質の解明も大きな課題
デスレセプターの基礎研究は、アポトーシス研究に貢献した後、他の生理機能の研究に貢献していくと期待される
デスレセプター誘導アポトーシスを制御することによる臨床応用の試みもなされている
TRAILを用いたがん治療、TRAILレセプターに対する顎にスティックなモノクローナル抗体によるがん治療、Fasシグナルを抑制することによる抗炎症治療など
→第2章 ストレスキナーゼによる細胞死制御